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蚂蚁防静电 / 2014-12-06
中华人民共和国国家标准
GB/T16293—1996
医药工业洁净室（区）浮游菌的
测 试 方 法
Test method for airborne microbe in clean
room(area) of the pharmaceutical industry
1 范围
本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中浮游菌测试条件、测试方法。
本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的浮游菌的测定和环境的验证。
2 引用标准
下列标准包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
YY/T 0188.6—1995 药品检验操作规程 第6部分：药品生物测定法
3 定义
本标准采用下列定义。
3.1 洁净室（区） clean room（area）
对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其使用均具有减少对该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。
3.2 洁净工作台 cleaning work station
一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区。其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流罩、水平层流罩、垂直层流洁净工作台、水平层流洁净工作台、自净器等。
3.3 菌落 colony forming units
细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。通常用个数表示。
3.4 浮游菌 airborne microbe
用本标准提及的方法收集悬浮在空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
3.5 浮游菌浓度 airborne microbe concentration
单位体积空气中含浮游菌菌落数的多少，以计数浓度表示，单位是个/m3或个/L。
3.6 悬浮粒子 airborne particles
可悬浮在空气中的尺寸一般在0.001μm～1000μm之间的固体、液体或两者的混合物质，包括生物性粒子和非生物性粒子。
3.7 洁净度 cleanliness
洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子的允许统计数。
3.8 单向流 unidirectional air flow（曾称为层流laminar flow）
沿着平行流线，以单一通路以一定流速向单一方向流动的气流。
3.9 非单向流 nonunidirectional air flow（曾称为乱流turbulent flow）
具有多个通路循环特性或气流方向不平行的，不满足单向流定义的气流。
3.10 静态测试 at-rest test
洁净室（区）净化空气调节系统已处于正常运行状态，工艺设备已安装，洁净室（区）内没有生产人员的情况下进行的测试。
3.11 动态测试 operational test
洁净室（区）已处于正常生产状态下进行的测试。
4 测试方法
4.1 方法提要
本方法采用计数浓度法，即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基，经若干时间，在适宜的生长条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，从而判定洁净环境内单位体积空气中的活微生物数，以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.2 所用的仪器、设备和培养基
a）浮游菌采样器；
b）真空抽气泵；
c）培养皿；
d）培养基；
e）恒温培养箱。
4.3 浮游菌采样器
浮游菌采样器宜采用撞击法机理的采样器，一般采用狭缝式采样器或离心式采样器。
4.3.1 采用的浮游菌采样器必须要有流量计和定时器。
4.3.2 狭缝式采样器的原理
狭缝式采样器由附加的真空抽气泵抽气，通过采样器的缝隙式平板，将采集的空气喷射并撞击到缓慢旋转的平板培养基表面上，附着的活微生物粒子经培养后形成菌落，予以计数。
4.3.3 离心式采样器的原理
离心式采样器由于内部风机的高速旋转，气流从采样器前部吸入从后部流出，在离心力的作用下，空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到专用的固形培养条上，经培养后形成菌落，予以计数。
4.3.4 狭缝式采样器的使用要点
应严格按仪器说明书的要求进行操作。
4.3.4.1 校验
采样器必须按仪器的检定周期，定期对仪器作检定，以保证测试数据的可靠性。校验的项目有：定时器、转盘转速、流量计。
4.3.2 每次测试前应按说明书上的规定，先接通电源，启动真空抽气泵，然后调节流量计及定时器。
4.3.4.3 空气采样量根据需要选定。已知采样器的流量（L/min），设定采样时间（min），两者相乘即采样量（L）。
4.3.4.4 注意事项
4.3.4.4.1 采样口必须用便于消毒及化学性能稳定的材料制造。
4.3.4.4.2 采样管严禁渗漏，内壁应光滑。
4.3.4.4.3 采样管的长度应根据测点的高度定，尽量减少弯曲。
4.4 真空抽气泵
4.4.1 真空抽气泵的排气量应与采样器匹配。
4.4.2 宜采用无油真空抽气泵，必要时可在非气口安装气体过滤器。
4.4.3 真空抽气泵安装的位置必须适当，一般装在采样器下面。
4.5 培养皿
4.5.1 狭缝式采样器一般采用Æ 150mm×15mm、Æ 90mm×15mm、Æ 65mm×15mm三种规格的硼硅酸玻璃培养皿。可根据所选用采样器选择合适的培养皿。
4.5.2 离心式采样器采用专用的固形培养条。
4.6 培养基
普通肉汤琼脂培养基或其他药典认可的培养基。其配制方法见附录A（标准的附录）。
4.7 恒温培养箱
必须定期对培养箱的温度计进行检定。
4.8 测试步骤
4.8.1 测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。
4.8.1.1 采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用于100级洁净室的采样器宜一直放在被测房间内。
4.8.1.2 用消毒剂擦净培养皿的外表面。
4.8.1.3 采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。
4.8.1.4 采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。
4.8.1.5 采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒。
4.8.2 狭缝式采样器的采样程序
4.8.2.1 仪器经消毒后先不放入培养皿，开动真空泵抽气，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并调好流量、转盘转速。
4.8.2.2 关闭真空泵，放入培养皿，盖上盖子后调节采样器缝隙高度。
4.8.2.3 置采样口于采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。
4.8.3 培养
4.8.3.1 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
4.8.3.2 在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。
4.8.3.3 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。
4.8.4 菌落计数
4.8.4.1 用肉眼直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
4.8.4.2 若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
4.8.5 注意事项
4.8.5.1 使用前仔细检查每个培养皿的质量，培养基及培养皿有变质、破损或污染的不能使用。
4.8.5.2 采取一切措施防止采样管的污染和其他人为对样本的污染。
4.8.5.3 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.8.5.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落或培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
5 测试规则
5.1 测试状态
5.1.1 浮游菌测试前，被测试洁净室（或洁净区）温、湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
5.1.2 浮游菌测试前，被测试洁净室（或洁净区）已经过消毒。
5.1.3 测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。
5.2 测试人员
5.2.1 测试人员必须穿戴符合环境级别的工作服。
5.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于2人。
5.3 测试时间
5.3.1 对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10 min后开始。
5.3.2 对非单向流，如10 000级，100 000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30 min后开始。
5.4 浮游菌浓度计算
5.4.1 采样点数量及其布置
5.4.1.1 最少采样点数目
浮游菌测试的最少采样点数目分为日常监测及环境验证两种情况，见表1。
表1 最少采样点数目
面 积
m2
洁 净 度 级 别
100
10 000
100 000
验证
监测
<10
2～3
1
2
—
≥10～<20
4
≥20～<40
8
3
≥40～<100
16
≥100～<200
40
10
≥200～<400
80
20
6
400
160
13
注：1）表1中的面积，对于100级的单向流洁净室（包括层流工作台），指的是送风口表面积，对于10 000级，100 000级的非单向流洁净室，指的是房间面积。
2）日常监测的采样点数目由生产工艺的关键操作点来确定。
a）对每个100级洁净操作区域（如层流罩、层流工作台），可在离药物敞开口处30cm处设测点，每班一次。
b）对每个10 000级洁净工作区域（如药物开口工作区）可在工作面处设测点，每班一次。
5.4.1.2 采样点的位置
采样点位置可以同悬浮粒子测试点。
a）工作区测点位置离地0.8～1.5m左右（略高于工作面）。
b）送风口测点位置离开送风面30cm左右。
c）可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。
采样点布置的规则见附录B（标准的附录）。
5.4.2 最小采样量
采样量根据日常检测及环境验证定，每次最小采样量见表2。
表2 最小采样量
洁净度级别
采样量，L/次
日常监测
环境验证
100级
600
1 000
10 000级
500
100 000级
0
5.4.3 采样次数
每个采样点一般采样一次。
5.4.4 采样注意事项
5.4.4.1 对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方向；对于非单向流，采样管口向上。
5.4.4.2 布置采样点时，至少应离开尘粒较集中的回风口1m以上。
5.4.4.3 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧。
5.5 记录
测试报告中应记录房间温度、相对湿度、压差及测试状态。
测试报告的编写见附录C（标准的附录）。
5.6 结果计算
5.6.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数。
5.6.2 每个测点的浮游菌平均浓度的计算，见式（1）。
平均浓度（个/m3）= ··············· （1）
例1：某测点采样量为400L，菌落数为1，则：
平均浓度= =2.5个/m3
例2：某测点采样量为2m3，菌落数为3，则：
平均浓度= =1.5个/m3
5.7 结果评定
用浮游菌平均浓度判断洁净室（区）空气中的微生物。
5.7.1 每个测点的浮游菌平均浓度必须低于所选定的评定标准中关于细菌浓度的界限。
5.7.2 若某测点的浮游菌平均浓度超过评定标准，则必须对此区域先行消毒，然后重新采样两次，两次测试结果必须合格。
附 录 A
（标准的附录）
培养基的准备及灭菌
A1 培养基的准备
培养基可以外购或自行配制。自行配制方法见YY/T0188.6第6章无菌检查部分中关于此类培养基的配备和操作步骤。其他符合药典灵敏度要求的培养基亦可以自行配制。
A2 培养基平皿的制备
A2.1 将培养皿置于121℃湿热灭菌20min或180℃干热灭菌2h。
A2.2 将培养基加热熔化，冷却至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿。
注入量：j65mm培养皿 约10mL
j90mm培养皿 约20mL
j150mm培养皿 约60mL
A3 细菌的培养
待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30℃～35℃的恒温培养箱中培养48h，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
注：培养基平皿宜在2℃～8℃的环境中存放。
附 录 B
采样点布置
洁净室和洁净区采样点的布置力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，某局部区域于稀疏。下列采样点布置的图示可作参考。
附 录 C
浮游菌测试报告
测试单位 测试日期
测试依据 生产批号
测试区域（房间或层流工作台）
面积 m2测试状态
温度 ℃相对湿度 %
静压差 Pa采样器名称
型号 培养基名称
送风口
工作区
采样点编号No.
采样速率，L/min
采样量，m3
开始时间
菌落数，CFU
平均浓度，CFU/m3
最高浓度 CFU/m3 最低浓度 CFU/m3
评定标准 结论
测试人 日期
结果报告人 日期
批准人 日期
附 录 D
（提示的附录）
国内外有关浮游菌测定的标准
表 D1
美国NASA标准
NHB5340—2
世界卫生组织（WHO）GMP
及欧洲共同体（EC）GMP
中国卫生部GMP（1992年修订）
生物性粒子最大允许数/m3
微生物的最大允许数/m3
活微生物数/m3
3.5
5
≤5
17．6
≤100
88.4
≤500
GB/T16294—1996
医药工业洁净室（区）沉降菌的
Test method for settling microbe in clean
本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中沉降菌的测试条件、测试方法。
本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境的验证。
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
YY/T0188.6—1995药品检验操作规程 第6部分：药品生物测定法
本标准采用下列定义
3.1 洁净室（区） clean room(area)
一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流置、水平层流罩、垂直层流洁净工作、水平层流洁净工作台、自净器等。
3.3 洁净度 cleanliness
3.4 菌落 colony forming unist
3.5 沉降菌 settling microbe
用本标准提及的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
3.6 悬浮粒子 ailborne Paritical
可悬浮在空气中的尺寸一般在0.001μm～1 000μm之间的固体、液体或两者的混合物质，包括生物性粒和非生物性粒子。
3.7 单向流unidirectional air flow（曾称为层流laminar flow）
3.8 非单向流nonunidirectional air flow（曾称为乱流turbulent flow）
3.9 静态测试 at—rest test
3.10 动态测试 operational test
4.1 方法概述
本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.2 所用的仪器和设备
4.2.1 高压消毒锅
使用时应严格按照仪器说明书操作。
4.2.2 恒温培养箱
4.2.3 培养皿
一般采用Æ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
4.2.4 培养基
4.3 测试步骤
4.3.1 采样方法
将已制备好的培养皿按5.4.1.2的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。
4.3.2 培养
4.3.2.1 全部采样结束后，将培养倒置于恒温培养箱中培养。
4.3.2.2 在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。
4.3.2.3 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。
4.3.3 菌落计数
4.3.3.1 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不否遗漏。
4.3.3.2 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。
4.4 注意事项
4.4.1 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
4.4.2 采取一切措施防止人为对样本的污染。
4.4.3 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.4.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉定物的区别，必要时用显微镜鉴别。
4.4.5 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
5.1.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
5.1.2 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。
5.2.1 测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
5.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。
5.3.1 对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。
5.3.2 对非单向流，如10 000级、100 000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
5.4 沉降菌计数
5.4.1 采样点数目及其布置
沉降法的最少采样点数可按表1确定。
≥～<20
≥～<40
≥400～<1000
≥1 000～<2 000
32
2000
800
200
63
注：表中的面积，对于单向流洁净室，指的是送风面面积，对非单向流洁净室是指的房间面积。
在满足最少测点数的同时，还宜满足最少培养皿数，见表2。
表2 最少培养皿数
所需Æ90mm培养皿数（以沉降0.5h 计）
14
5.4.1.2 采样点的布置
采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。
a）工作区采样点的位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。
b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
采样点位置的详细规则见附录B（标准的附录）。
沉降菌测试报告
编 号 测试单位
测试依据 测试状态
环境温度 ℃相对湿度 %
培养基批号 培养温度
检测日期 静压差 Pa
报告日期
菌 落 数
区域
平皿
平均数
级别
备注
检验者 复核者
附录D
国内外有关沉降菌测定的标准
表D1
日本制药协会
中国化学制药工业协会
个/（Æ90mm·1h）
个/（Æ90mm·0.5h）
0.49
≤1
2.45
≤3
12.2
≤10
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